Capitolo 3 Introduzione al disegno sperimentale

3.1 Definizioni

La ricerca scientifica trova la sua unità elementare nell’esperimento, cioè un processo investigativo, con il quale, seguendo un adeguato protocollo, si osserva e si misura la risposta prodotta da uno o più fattori sperimentali nei soggetti coinvolti nello studio. Raramente gli esperimenti sono isolati, più spesso fanno parte di uno sforzo collettivo organizzato, generalmente identificato come progetto di ricerca.

Ogni esperimento deve essere attentamente pianificato. Infatti, sappiamo che la variabilità esistente tra soggetti sperimentali, il campionamento, le irregolarità di misura e molti altri fattori perturbativi ci impediscono di osservare la realtà con assoluta precisione. E’ come se osservassimo un fenomeno attraverso una sorta di lente deformante, che ci impone di adottare un metodo sperimentale rigoroso, per evitare di attribuire al fenomeno in studio effetti che sono invece puramente casuali.

Schematizzazione del processo sperimentale

In particolare, gli esperimenti debbono essere:

Precisi
Accurati
Replicabili/Riproducibili

In mancanza di questi requisiti, al termine dell’esperimento possono rimanere dubbi sui risultati, tali da inficiare la validità delle conclusioni raggiunte.

Forse vale la pena di chiarire cosa si intende con precisione, accuratezza e replicabilità/riproducibilità. Abbiamo già visto che la presenza dell’errore sperimentale ci impone di ripetere le misure più volte. La precisione di un esperimento non è altro che la variabilità dei risultati tra una replica e l’altra.

La precisione, da sola, non garantisce che l’esperimento sia affidabile. Abbiamo menzionato nel capitolo precedente che l’errore sperimentale può essere casuale o sistematico. Quest’ultimo può essere dovuto, per esempio, ad uno strumento non accurato che sovrastima tutte le misure. In questo caso, posso ripetere cento volte la misura, ottenendo sempre lo stesso risultato, molto preciso, ma totalmente inaffidabile, nel senso che non riflette la misura reale del soggetto. E’questa l’accuratezza, cioè la capacità di una misura (o di un esperimento) di restituire il valore reale, anche se dopo come media di numero molto elevato di replicazioni.

L’accuratezza è molto più importante della precisione: infatti una misura accurata, anche se imprecisa, riflette bene la realtà, anche se in modo vago. Al contrario, una misura precisa ma inaccurata ci porta completamente fuori strada, perchè non riflette la realtà! Un esperimento/risultato non accurato si dice ‘distorto’ (biased).

Oltre a precisione ed accuratezza, siamo anche interessati alla replicabilità di un esperimento, cioè alla possibilità che questo, se ripetuto in condizioni assolutamente analoghe (stessi soggetti, ambiente, strumenti…) restituisca risultati equivalenti. Alcuni biostatistici distinguono la replicabilità dalla riproducibilità, in quanto considerano quest’ultima come la possibilità di ottenere risultati equivalenti ripetendo una misura in condizioni diverse (diversi soggetti, diverso ambiente…). E’evidente che un esperimento può essere totalmente accurato e replicabile, ma non riproducibile con soggetti e condizioni ambientali diverse. Se è così, le conclusioni raggiunte, anche se accurate, non possono essere generalizzate.

3.2 Elementi fondamentali del disegno sperimentale

La metodica di organizzazione di un esperimento prende il nome di disegno sperimentale e deve essere sempre adeguatamente formalizzata tramite la redazione di un protocollo sperimentale sufficientemente dettagliato da consentire a chiunque la replicazione dell’esperimento e la verifica dei risultati.

Le basi del disegno sperimentale si fanno in genere risalire a Sir Ronald A. Fisher, vissuto in Inghilterra dal 7 Febbraio 1890 al 29 luglio 1962. Laureatosi nel 1912, lavora come statistico per il comune di Londra, fino a quando diviene socio della prestigiosa Eugenics Education Society di Cambridge, fondata nel 1909 da Francis Galton, cugino di Charles Darwin. Dopo la fine della guerra, Karl Pearson gli propone un lavoro presso il rinomato Galton Laboratory, ma egli non accetta a causa della profonda rivalità esistente tra lui e Pearson stesso. Nel 1919 viene assunto presso la Rothamsted Experimental Station, dove si occupa dell’elaborazione dei dati sperimentali e, nel corso dei successivi 7 anni, definisce le basi del disegno sperimentale ed elabora la sua teoria della “analysis of variance”. Il suo libro più importante è “The design of experiment”, del 1935. E’ sua la definizione delle tre componenti fondamentali del disegno sperimentale:

controllo degli errori;
replicazione;
randomizzazione.

3.2.1 Controllo degli errori

Controllare gli errori, o, analogamente, eseguire un esperimento controllato signfica fondamentalmente due cose:

adottare provvedimenti idonei ad evitare le fonti di errore, mantenendole al livello più basso possibile (alta precisione);
agire in modo da isolare l’effetto in studio (accuratezza), evitando che si confonda con effetti casuali e di altra natura.

Declinare questi principi richiederebbe una vita di esperienza! Vogliamo solo ricordare alcuni aspetti fondamentali.

3.2.1.1 Campionamento corretto

E’evidente che il primo requisito di un esperimento è una corretta scelta delle unità sperimentali, cioè le più piccole unità che ricevono lo ‘stimolo’ rappresentato dal trattamento, in modo indipendente da tutte le altre.

E’ bene subito comprendere una fondamentale distinsione tra unità sperimentali e unità osservazionali. Le prime sono appena state definite; le seconde sono quelle che costituiscono l’oggetto della misura e possono anche non coincidere con le prime. Ad esempio: immaginiamo di trattare con un diserbante due vasetti, in modo indipendente l’uno dall’altro. Immaginiamo poi di pesare singolarmente le quattro piante di ciascun vasetto; in questa situazione, il vasetto è l’unità sperimentale, le piante sono invece le unità osservazionali. L’elemento discriminante di questo esempio è l’indipendenza: mentre le unità sperimentali hanno ricevuto il trattamento in modo indipendente l’una dall’altra, le unità osservazionali no. Questa differenza è fondamentale, per motivi che vedremo più avanti.

Le unità sperimentali possono essere di varia natura; nel caso degli esperimenti di campo, le unità sperimentali sono dette parcelle e sono un pezzetto di terreno, di varia forma e dimensione.

Una prova sperimentale in campo (Foto D. Alberati)

Le unità sperimentali sono scelte per campionamento, che è un elemento fondamentale dell’esperimento. Infatti, il censimento, che riguarda tutti i soggetti di un certo ambito, non è, in se’, un esperimento. Ovviamente, il campione deve essere rappresentativo, altrimenti l’esperimento è invalido.

Non è possibile dare indicazioni specifiche di campionamento, perché queste dipendono dalla tipologia di esperimento. Illustriamo quindi solo alcuni criteri generali.

Prima di campionare, dobbiamo avere una chiara visione della cornice di campionamento, cioè della popolazione da cui io devo campionare. Devo effettuare un esperimento valido per l’Italia centrale, per una località particolare, per tutta Italia. Devo fare un esperimento che riguarda una stalla in particolare o tutte le stalle dove si allevano bovini? Di quale razza? E’ un passaggio fondamentale, in quanto poi le conclusioni non possono che riferirsi alla cornice della popolazione da cui il campione è stato estratto, non altre. Per esperimenti nell’ambito delle scienze sociali, diviene fondamentale che la cornice di campionamento abbia le seguenti caratteristiche:

le unità sono tutte identificabili e reperibili
le unità sono tutte caratterizzate (es. Id)
è aggiornata e organizzata logicamente
non mancano soggetti (che potrebbero quindi sfuggire al campionamento)
non ci sono soggetti duplicati
non ci sono elementi estranei

Una volta che la popolazione è nota ed organizzata, dobbiamo trovare un criterio di selezione. Fondamentalmente ci sono tre possibilità:

campionamento randomizzato (casuale)
campionamento stratificato
campionamento sistematico

Il campionamento randomizzato è tale che ogni soggetto ha la stessa possibilità di ogni altro di essere incluso nel campione. Tipicamente, questo campionamento è basato su un generatore di numeri casuali, con distribuzione uniforme delle frequenze. Il codice sottostante serve per ottenere cinque elementi casuali da un lotto di 48 identificati con numeri progressivi.

sample(1:48, 4)

## [1] 13 29 40 23

Il campionamento casuale può non dare garanzie sufficienti di rappresentatività. Per questo motivo, a volte, si utilizza il campionamento stratificato, con il quale si divide la cornice di campionamento in gruppi omogenei e si prelevano un certo numero di soggetti da ogni gruppo. In questo caso è bene ricordare che potrebbe essere auspicabile mantenere nel campione la stessa relazione tra gruppi che esiste nella popolazione. Ad esempio, se in una popolazione di insetti c’è il 10% di maschi e il 90% di femmine, io devo prelevare \(n\) maschi e \(m\) femmine, tale che \(n/m = 0.1\), altrimenti il campione che ottengo potrebbe non essere rappresentativo.

A volte, il campionamento può essere sistematico, nel senso che utilizzo un criterio non casuale, ma in grado di assicurare una certa rappresentatività. Ad esempio, per campionare gli edifici di una via, potrei decidere di prendere il primo a caso e poi procedere prendendone uno si e tre no. Questo campionamento è molto veloce e di facile esecuzione, ma può dare origine a distorsioni.

Una forma di campionamento è quella a cluster: in questo caso suddivido gli elementi in gruppi, scelgo a caso un certo numero di gruppi e poi prendo tutti gli elementi di un gruppo. Ad esempio, devo selezionare i bambini delle scuole elementari del comune di Perugia. In questo caso, invece che selezionare i bambini, posso più velocemente selezionare le scuole e prendere tutti i bambini delle scuole selezionate. Evidentemente il metodo si basa sull’ipotesi che la selezione rappresentativa delle scuole crea anche una selezione rappresentativa di bambini.

A volte si esegue anche un campionamento a quota, cioè si prendono tutti i soggetti che si incontrano in una certa situazione, fino a che non se ne raccolgono un numero prefissato, per alcune classi specificate (Es. 30 donne, 25 uomini, 15 adolescenti e 20 bambini). Questo tipo di campionamento è talvolta utilizzato negli esperimenti medici.

3.2.1.2 Rigore

Direi che questo aspetto è ovvio e non richiede commenti particolari: una ricerca deve essere condotta ‘a regola d’arte’. E’ evidente che, ad esempio, se vogliamo sapere la cinetica di degradazione di un erbicida a 20 °C dovremo realizzare una prova esattamente a quella temperatura, con un erbicida uniformemente distribuito nel terreno, dentro una camera climatica capace di un controllo perfetto della temperatura. Gli strumenti dovranno essere ben tarati e sarà necessario attenersi scrupolosamente a metodi validati e largamente condivisi.

Tuttavia, a proporsito di rigore, non bisogna scordare quanto diceva C.F. Gauss a proposito della precisione nei calcoli, e che puà essere anche riferito al rigore nella ricerca : “Manca di mentalità matematica tanto chi non sa riconoscere rapidamente ciò che è evidente, quanto chi si attarda nei calcoli con una precisione superiore alla necessità”

3.2.1.3 Omogeneità

Anche in questo caso, l’importanza di scegliere soggetti uniformi e posti in un ambiente uniforme (nello spazio e nel tempo) è evidente. Bisogna comunque tener presente che i risultati di un esperimento si estendono alla popolazione da cui il campione è estratto e della quale esso rappresenta le caratteristiche. Esperimenti nei quali si restringe il campo di variabilità dei soggetti e dell’ambiente sono certamente più precisi, ma forniscono anche risultati meno generalizzabili. L’importante è avere ben chiaro su quale è il campo di validità che si vuole dare ai risultati. Ad esempio, se si vuole ottenere un risultati riferito alla collina umbra, bisognerà scegliere soggetti che rappresentano bene la variabilità pedo-climatica della collina Umbra; né più, né meno.

3.2.1.4 Evitare le ‘intrusioni demoniache’

Secondo Hurlbert (1984), le intrusioni sono eventi totalmente casuali che impattano negativamente con un esperimento in corso. E’evidente che, ad esempio, un’alluvione, l’attacco di insetti o patogeni, la carenza idrica hanno una pesante ricaduta sulla precisione di un esperimento e sulla sua riuscita. Nello stesso lavoro, Hurlbert usa il termine ‘intrusione demoniaca’ per indicare quelle intrusioni che, pur casuali, avrebbero potuto essere previste con un disegno più accurato, sottolineando in questo caso la responsabilità dello sperimentatore.

Un esempio è questo: uno sperimentatore vuole studiare l’entità della predazione dovuta alle volpi e quindi usa campi senza steccionate (dove le volpi possono entrare) e campi protetti da steccionate (e quindi liberi da volpi). Se le steccionate, essendo utilizzate dai falchi come punto d’appoggio, finiscono per incrementare l’attività predatoria di questi ultimi, si viene a creare un’intrusione demoniaca, che rende l’esperimento distorto. Il demonio, in questo caso, non è il falco, che danneggia l’esperimento, ma il ricercatore stesso, che non ha saputo prevedere una possibile intrusione.

3.2.2 Replicazione

In ogni esperimento, i trattamenti dovrebbe essere replicati su 2 o più unità sperimentali. Ciò permette di:

dimostrare che i risultati sono replicabili (ma non è detto che siano riproducibili!)
rassicurare che eventuali circostanze aberranti casuali non abbiano provocati risultati distorti
misurare l’errore sperimentale, come variabilità di risposta tra repliche trattate nello stesso modo (precisione dell’esperimento)
incrementare la precisione dell’esperimento (più sono le repliche più l’esperimento è preciso, perchè si migliora la stima della caratteristica misurata, diminuendo l’incertezza)

Per poter essere utili, le repliche debbono essere indipendenti, cioè debbono aver subito tutte le manipolazioni necessarie per l’allocazione del trattamento in modo totalmente indipendente l’una dall’altra. Le manipolazioni comprendono tutte le pratiche necessarie, come ad esempio la preparazione delle soluzioni, la diluizione dei prodotti, ecc..

La manipolazione indipendente è fondamentale, perchè in ogni parte del processo di trattamento possono nascondersi errori più o meno grandi, che possono essere riconosciuti solo se colpiscono in modo casuale le unità sperimentali. Se la manipolazione è, anche solo in parte, comune, questi errori colpiscono tutte le repliche allo stesso modo, diventano sistematici e quindi non più riconoscibili. Di conseguenza, si inficia l’accuratezza dell’esperimento. Quando le repliche non sono indipendenti, si parla di pseudorepliche, contrapposte alle repliche vere.

Il numero di repliche dipende dal tipo di esperimento: più sono e meglio è, anche se è necessario trovare un equilibrio accettabile tra precisione e costo dell’esperimento. Nella sperimentazione di campo, 2 repliche sono poche, 3 appena sufficienti, 4 costituiscono la situazione più comune, mentre un numero maggiore di repliche è abbastanza raro, non solo per la difficoltà di seguire l’esperimento, ma anche perché aumentano la dimensione della prova e, di conseguenza, la variabilità del terreno.

3.2.3 Randomizzazione

L’indipendenza di manipolazione non garantisce da sola un esperimento corretto. Infatti potrebbe accadere che le caratteristiche innate dei soggetti, o una qualche ‘intrusione’ influenzino in modo sistematico tutte le unità sperimentali trattate nello stesso modo, così da confondersi con l’effetto del trattamento. Un esempio banale è che potremmo somministrare un farmaco a quattro soggetti in modo totalmente indipendente, ma se i quattro soggetti fossero sistematicamente più alti di quelli non trattati finiremmo per confondere una caratteristica innata con l’effetto del farmaco. Oppure, se le repliche di un certo trattamento si trovassero tutte vicine alla scolina, potrebbero essere più danneggiate delle altre unità sperimentali dal ristagno idrico, il cui effetto si confonderebbe con quello del trattamento stesso.

Questi problemi sono particolarmente insidiosi e si nascondono anche dietro ai particolari apparentemente più insignificanti. La randomizzazione è l’unico sistema per evitare, o almeno rendere molto improbabile, la confusione dell’effetto del trattamento con fattori casuali e/o comunque diversi dal trattamento stesso. La randomizzazione si declina in vari modi:

allocazione casuale del trattamento alle unità sperimentali. Gli esperimenti che prevedono l’allocazione del trattamento sono detti ‘manipolativi’ o ‘disegnati’.
A volte l’allocazione del trattamento non è possibile o non è etica. Se volessimo studiare l’effetto delle cinture di sicurezza nell’evitare infortuni gravi, non potremmo certamente provocare incidenti deliberati. In questo caso la randomizzazione è legata alla scelta casuale di soggetti che sono ‘naturalmente’ trattati. Esperimenti di questi tipo, si dicono osservazionali. Un esempio è la valutazione dell’effetto dell’inquinamento con metalli pesanti nella salute degli animali: ovviamente non è possibile, se non su piccola scala, realizzare il livello di inquinamento desiderato e, pertanto, dovremo scegliere soggetti che sono naturalmente sottoposti a questo genere di inquinamento, magari perché vivono vicino a zone industriali.
Se i soggetti sono immobili, la randomizzazione ha anche una connotazione legata alla disposizione spaziale e/o temporale casuale.

L’assegnazione casuale del trattamento, o la selezione casuale dei soggetti trattati, fanno si che tutti i soggetti abbiano la stessa probabilità di ricevere qualunque trattamento oppure qualunque intrusione casuale. In questo modo, la probabilità che tutte le repliche di un trattamento abbiano qualche caratteristica innata o qualche intrusione comune che li penalizzi/avvantaggi viene minimizzata. Di conseguenza, confondere l’effetto del trattamento con variabilità casuale (‘confounding’), anche se teoricamente possibile, diviene altamente improbabile.

3.2.3.1 Gradienti e blocking

Un esperimento in cui l’allocazione del trattamento, o la scelta dei soggetti trattati, o la disposizione spaziale dei soggetti sono totalmente casuali si dice ‘completamente randomizzato’. E’ perfettamente valido, perchè non pone dubbi fondati di inaccuratezza. Tuttavia, in alcune circostanze è possibile porre restrizioni (vincoli) alla randomizzazione, perchè ciò porta ad un esperimento più preciso.

In particolare, le unità sperimentali possono presentare delle differenze, ad esempio di fertilità, oppure di sesso. Ad esempio, randomizzare completamente l’allocazione dei trattamenti potrebbe far si che tra le repliche di un trattamento vi siano più maschi che femmine, il che crea un certo livello di ‘confounding’. Pertanto potrebbe essere utile divider i soggetti in due gruppi (maschi e femmine), oppure in più gruppi (molto fertile, mediamente fertile, poco fertile…) e randomizzare i trattamenti all’interno di ogni gruppo.

In generale, il blocking consiste nel suddividere i soggetti in gruppi uniformi e ripetere lo stesso esperimento (o parte di esso) all’interno di ciascun gruppo, cioè in una situazione di maggiore omogeneità.

Il raggruppamento delle unità sperimentali può tener conto di:

vicinanza spaziale (campi, parcelle, stalle …)
caratteristiche fisiche (età, peso, sesso … )
vicinanza temporale
gestione dei compiti (tecnico, valutatore, giudice …)

Chiaramente, randomizzare all’interno del gruppo invece che randomizzare completamente crea un vincolo. A volte i vincoli sono più di uno. Vediamo un esempio. Una certa operazione industriale richiede un solo operatore per essere portata a termine, ma può essere eseguita in quattro modi diversi. Pianificate un esperimento per stabilire qual è il metodo più veloce, avendo a disposizione solo quattro operatori.

L’unità sperimentale è il lavoratore. I metodi sono quattro e, volendo lavorare con quattro repliche, avremmo bisogno di sedici operatori per disegnare un esperimento completamente randomizzato. Possiamo tuttavia considerare che un operatore, in quattro turni successivi, può operare con tutti e quattro i metodi. Quindi possiamo disegnare un esperimento in cui il turno fa da unità sperimentale e l’operatore fa da blocco (blocchi randomizzati). Tuttavia, in ogni blocco (operatore) vi è un gradiente, nel senso che i turni successivi al primo sono via via meno efficienti, perché l’operatore accumula stanchezza. Per tener conto di questo potremmo allora introdurre un vincolo ulteriore, per ogni operatore, randomizzando i quattro metodi tra i turni, in modo che ogni metodo, in operatori diversi, capiti in tutti i turni. In sostanza, l’operatore fa da blocco, perché in esso sono contenuti tutti i metodi. Ma anche il turno (per tutti gli operatori) fa da blocco, in quanto in esso sono ancora contenuti tutti i metodi. Se non vi è chiaro, ci torneremo sopra più tardi.

Posto che non si deve violare l’indipendenza delle repliche, l’inclusione di vincoli alla randomizzazione è consentita, ma questa deve sempre essere tenuta presente in fase di analisi dei dati.

Ronald Fisher diceva “Analyse them as you have randomised them”. Meglio seguire il consiglio.

3.2.3.2 E se ricercatori/soggetti sono influenzabili?

Per concludere questa parte, è opportuno menzionare il fatto che, in un esperimento scientifico, il fatto che lo sperimentatore e il soggetto siano coscienti del trattamento somministrato può portare a risultati distorti. Per esempio, nell’eseguire un rilievo, lo sperimentatore può essere influenzato dal sapere con quale diserbante è stata trattata una parcella, cercando inconsciamente conferme alle sue conoscenze pregresse. D’altro canto, nei soggetti sperimentali dotati di coscienza (uomo) sapere di essere stati trattati può influenzare l’esito del trattamento (effetto placebo).

Per evitare questi problemi, soprattutto in ambito medico, un esperimento può essere pianificato come:

cieco: l’unità sperimentale o lo sperimentatore non sono coscienti dei dettagli del trattamento;
doppio cieco: né l’unità sperimentale né lo sperimentatore sono a coscienza dei dettagli del trattamento

Un esperimento cieco e/o doppio cieco possono non essere eticamente corretti oppure inutili, nel qual caso si torna ad un esperimento tradizionale ‘aperto’ (open experiment: Tutti sanno tutto’)

3.2.4 Esperimenti non validi

A questo punto dovrebbero essere chiare le caratteristiche di un esperimento valido. A completamento, cerchiamo di elencare le caratteristiche di un esperimento non valido.

Cattivo controllo degli errori
Fondati sospetti di confounding
Mancanza di repliche vere
Confusione tra repliche vere e pseudo-repliche
Mancanza di randomizzazione
Presenza di vincoli alla randomizzazione, trascurati in fase di analisi.

Le conseguenze di queste problematiche sono abbastanza diverse.

3.2.4.1 Cattivo controllo degli errori

Bisogna verificare se il problema è relativo a questioni come la mancanza di scrupolosità, l’uso di soggetti poco omogenei o di un ambiente poco omogeneo, o altri aspetti che inficiano solo la precisione, ma non l’accuratezza dell’esperimento. In questo caso, l’esperimento è ancora valido (accurato), ma la bassa precisione probabilmente impedirà di trarre conclusioni forti. Quindi, un esperimento impreciso si ‘elimina’ da solo, perché sarà inconclusivo. Di questi esperimenti bisogna comunque diffidare, soprattutto quando siano pianificati per mostrare l’assenza di differenze tra due trattamenti alternativi. Mostrare l’assenza di differenze è facile: basta fare male un esperimento, in modo che vi sia un alto livello di incertezza e quindi l’evidenza scientifica sia molto debole.

Diversa è la situazione in cui un cattivo controllo degli errori, ad esempio l’adozione di metodi sbagliati, porta a mancanza di accuratezza, cioè a risultati che non riflettono la realtà (campionamento sbagliato, ad esempio; oppure strumenti non tarati; impiego di metodi non validati e/o non accettabili). In questo caso venendo a mancare l’accuratezza, l’esperimento deve essere rigettato, in quanto non fornisce informazioni realistiche.

3.2.4.2 Confounding e correlazione spuria

Abbiamo appena menzionato il problema fondamentale della ricerca, cioè il confounding, vale a dire la confusione tra l’effetto del trattamento e un qualche altro effetto casuale, legato alle caratteristiche innate del soggetto o a qualche intrusione più o meno ‘demoniaca’. Abbiamo detto che non possiamo mai avere la certezza dell’assenza di confounding, ma abbiamo anche detto che l’adozione di una pratica sperimentale corretta ne minimizza la probabilità.

Chiaramente, rimangono dei rischi che sono tipici di situazioni nelle quali il controllo adottato non è perfetto, come capita, ad esempio, negli esperimenti osservazionali. In questo ambito è piuttosto temuta la cosiddetta ‘correlazione spuria’, una forma di confounding casuale per cui due variabili variano congiuntamente (sono direttamente o inversamente proporzionali), ma in modo del tutto casuale. Esistono, ad esempio, dati che mostrano una chiara correlazione tra le vendite di panna acida e le morti per incidenti in motocicletta. Chiaramente, non esistono spiegazioni scientifiche per questo effetto, che è, ovviamente, del tutto casuale. Il problema è che questa correlazione spuria non è sempre così semplice da rintracciare.

Esempio di correlazione spuria

A volte il confounding non è casuale, ma è legato ad una variabile esterna che si agisce all’insaputa dello sperimentatore. Ad esempio, è stato osservato che il tasso di crimini è più alto nelle città che hanno più chiese. La spiegazione di questo paradosso sta nel fatto che esiste un ‘confounder’, cioè l’ampiezza della popolazione. Nelle grandi città si riscontrano sia una maggiore incidenza criminale, sia un grande numero di chiese. In sostanza, la popolazione determina sia l’elevato numero di chiese che l’elevato numero di crimini, ma queste ultime due variabili non sono legate tra loro da una relazione causa-effetto (A implica B e A implica C, ma B non implica C).

Il confounding non casuale è spesso difficile da evidenziare, soprattutto se le correlazioni misurate sono spiegabili. Inoltre, non è eliminabile con un’accurata randomizzazione, ma solo con l’esecuzione di un esperimento totalmente controllato, nel quale ci si preoccupa di rilevare tutte le variabili necessarie per spiegare gli effetti riscontrati. Di questo è importante tener conto soprattutto negli esperimenti osservazionali, dove il controllo è sempre più difficile e meno completo.

3.2.4.3 Pseudo-repliche e randomizzazione poco attenta

Per evidenziare questi problemi e comprendere meglio la differenza tra un esperimento corretto e uno non corretto, è utilissima la classificazione fatta da Hurlbert (1984), che riportiamo di seguito.

Indicazioni per una corretta randomizzazione (Hurlbert, 1984)

Vengono mostrati 8 soggetti, sottoposti a due trattamenti (bianco e nero), con 8 disegni sperimentali diversi.

Il disegno A1 è corretto, in quanto si tratta di un esperimento completamente randomizzato. Ugualmente, è valido il disegno A2, nel quale le unità sperimentali sono state divise in quattro gruppi omogenei e sono state trattate in modo randomizzato all’interno di ogni gruppo.

Il disegno A3 è quantomeno ‘sospetto’: vi sono repliche vere, ma l’allocazione dei trattamenti non è randomizzata ed avviene con un processo sistematico per il quale ‘nero’ e ‘bianco’ si alternano. Cosa succederebbe se vi fosse un gradiente di fertilità decrescente da destra verso sinistra? Le unità nere sarebbero avvantaggiate rispetto alle bianche! Insomma, rimangono sospetti di confounding, a meno che non si sia assolutamente certi dell’assenza di gradienti, come capita ad esempio se all’interno dei blocchi, dobbiamo creare una sequenza spazio-temporale. Vediamo tre esempi:

ho quattro piante e, per ogni pianta, voglio confrontare un ramo basso con uno alto: è evidente che i due trattamenti sono sempre ordinati in modo sistematico (basso prima di alto).
Dobbiamo valutare l’effetto di fitofarmaci somministrati in due epoche diverse (accestimento e inizio-levata); anche qui non possiamo randomizzare, giacchè un’epoca precede sempre l’altra.
Dobbiamo confrontare la presenza di residui di un fitofarmaco a due profondità e non possiamo randomizzare, perché una profondità precede sempre l’altra nello spazio.

In queste situazioni l’esperimento rimane valido, anche se la randomizzazione segue un processo sistematico e non casuale.

Il disegno B1 è usualmente invalido: non vi è randomizzazione e ciò massimizza i problemi del disegno A3: la separazione delle unità sperimentali ‘bianche’ e ‘nere’ non consente una valutazione adeguata dell’effetto del trattamento, che è confuso con ogni potenziale differenza tra la parte destra e la sinistra dell’ambiente in cui la sperimentazione viene eseguita. Ovviamente, la separazione può essere non solo spaziale, ma anche temporale. Anche in questo caso diamo alcuni esempi in cui una situazione come quella descritta in B1 è valida:

Vogliamo confrontare la produzione in pianura e in collina. Ovviamente dobbiamo scegliere campioni in due situazioni fisicamente separate
Vogliamo confrontare la pescosità di due laghetti
Vogliamo confrontare la produttività di due campi contigui.

Queste situazioni sono valide, anche se con una restrizione: non siamo in grado di stabilire a chi debba essere attribuito l’effetto. Ad esempio, per la prima situazione, pianura e collina possono dare produzioni diverse per il suolo diverso, il clima diverso, la precessione colturale diversa o un qualunque altro elemento che differenzi le due località.

Il disegno B2 è analogo al disegno B1, ma il problema è più grave, perché la separazione fisica è più evidente. Questo disegno è totalmente sbagliato, a meno che non siamo specificatamente interessati all’effetto località (vedi sopra).

Il disegno B3 è analogo al disegno B2, ma costituisce una situazione molto frequente nella pratica scientifica. Immaginiamo infatti di voler confrontare la germinazione dei semi a due temperature diverse, utilizzando due camere climatiche e mettendo, in ognuna di esse, quattro capsule Petri identiche. In questa situazione, l’effetto temperatura è totalmente confuso con l’effetto ‘camera climatica (località)’ e risente di ogni malfunzionamente relativo ad una sola delle due camere. Inoltre, le unità sperimentali con lo stesso trattamento di temperature non sono manipolate in modo indipendente, dato che condividono la stessa camera climatica. Di conseguenza, non si può parlare di repliche vere, bensì di pseudorepliche.

Altri esempi di pseudorepliche sono schematizzati con il codice B4. Ad esempio:

trattare piante in vaso ed analizzare in modo indipendente i singoli individui invece che tutto il vaso;
trattare una parcella di terreno e prelevare da essa più campioni, analizzandoli separatamente;
trattare una capsula Petri ed analizzare separatamente i semi germinati al suo interno.

Questi disegni, in assenza di repliche vere aggiuntive non sono da considerarsi validi. Ad esempio, se io ho due vasetti trattati in modo totalmente indipendente e da ciascuno di essi prelevo due piante e le analizzo separatamente, il disegno è caratterizzato da due repliche vere e due pseudorepliche per ogni replica ed è, pertanto, valido.

Il disegno B5 è invece evidentemente invalido, per totale mancanza di repliche.

3.3 Progettazione di un esperimento (protocollo)

Qualunque sia l’ambito scientifico, in ogni esperimento possiamo individuare alcune fasi fondamentali, che proviamo ad elencare:

Individuazione del background (ricerca bibliografica)
ipotesi scientifica;
definizione dell’obiettivo;
identificazione dei fattore/i sperimentale/i;
identificazione dei soggetti sperimentali e delle repliche;
identificazione delle variabili da rilevare;
allocazione randomizzata dei trattamenti (mappa dell’esperimento)
Esecuzione dell’esperimento

Nell’analizzare questi aspetti, faremo riferimento ad alcuni esempi pratici, che verranno indicati tra breve.

3.3.1 Ipotesi scientifica \(\rightarrow\) obiettivo dell’esperimento

Trascurando la parte di ricerca bibliografica, che è pur fondamentale, nel metodo scientifico galileiano, il punto di partenza di un esperimento è l’ipotesi scientifica, che determina l’obiettivo dell’esperimento. Si tratta del passaggio fondamentale dal quale dipende in modo logico tutto il lavoro successivo. Gli obiettivi debbono essere:

rilevanti
chiaramente definiti;
specifici;
misurabili;
raggiungibili/realistici;
temporalmente organizzati.

Il rischio che si corre con obiettivi mal posti è quello di eseguire una ricerca dispersiva, con raccolta di dati non necessari e/o mancanza di dati fondamentali, con costi più elevati del necessario e un uso poco efficiente delle risorse. In genere, prima si definisce un obiettivo generale, seguito da uno o più obiettivi specifici, in genere proiettati su un più breve spazio temporale e che possono essere visti anche come le fasi necessarie per raggiungere l’obiettivo generale.

Poniamo quattro esempi pratici.

3.3.2 Casi di studio - 1

3.3.2.1 Esempio 1 - Diserbo chimico

Si suppone che gli erbicidi A, B e C siano più efficaci di D, E ed F verso Solanum nigrum, una comune pianta infestante delle colture di pomodoro. L’obiettivo generale della ricerca sarà quello di trovare un’efficace soluzione per l’eliminazione di Solanum nigrum dal pomodoro. Gli obiettivi specifici saranno:

valutare l’efficacia erbicida di A, B e C, confrontandola con quella di D, E ed F;
valutare la selettività degli anzidetti erbicidi verso il pomodoro;

3.3.2.2 Esempio 2 - Valutazione varietale

L’ipotesi è che le varietà di girasole A, B e C non hanno la stessa base genetica e quindi non sono tutte ugualmente produttive. L’obiettivo generale è quello di capire quale tra A, B e C sia più adatta alle condizioni pedoclimatiche della collina Umbra.

Gli obiettivi specifici sono quelli di valutare:

produttività di A, B e C
stabilità produttiva di A, B e C

3.3.2.3 Esempio 3 - Diserbo parziale

Nella barbabietola da zucchero, il diserbo localizzato lungo la fila consente di diminuire l’impiego di erbicidi. Tuttavia, se la coltura precedente ha prodotto semi e se non abbiamo effttuato una lavorazione profonda per interrarli, la coltura sarà più infestata e quindi sarà più difficile ottenere una buona produttività con il diserbo parziale.

Su questa ipotesi costruiamo un esperimento volto a valutare l’interazione tra lavorazione del terreno e diserbo chimico. Per raggiungere questo obiettivo generale, proveremo a valutare se:

il diserbo parziale consente di ottenere produzioni comparabili a quelle del diserbo totale; 2.l’effetto è indipendente dalla lavorazione effettuata.

3.3.2.4 Esempio 4 - Colture poliennali

L’ipotesi scientifica è affine a quella dell’esempio 2, ma, in questo caso, vogliamo porre a confronto tre varietà di erba medica (A, B e C). La differenza sta nel fatto che l’erba medica è una coltura poliennale e quindi vogliamo capire se il giudizio di merito è indipendente dall’anno di coltivazione.

I nostri obiettivi specifici saranno quindi:

valutare la produttività media delle varietà in prova
valutare le oscillazione nei quattro anni di durata del cotico erboso

3.3.2.5 Esempio 5 - Inquinamento da micotossine

Secondo le notizie in bibliografia, i datteri confezionati in vendita nei supermercati contengono elevate quantità di micotossine. L’obiettivo generale è quello di verificare il livello di infestazione e vedere se questo cambia con il metodo di confezionamento.

3.3.3 Identificazione dei fattori sperimentali

Dopo aver definito l’obiettivo di un esperimento, è necessario chiarire esattamente gli stimoli a cui saranno sottoposte le unità sperimentali. Uno ‘stimolo’ sperimentale prende il nome di fattore sperimentale, che può avere più livelli. I livelli del fattore sperimentale prendono il nome di trattamenti (o tesi) sperimentali.

3.3.4 Esperimenti (multi)fattoriali

In alcuni casi è necessario inserire in prova più di un fattore sperimentale. In questo caso si parla di esperimenti fattoriali, che possono essere incrociati (crossed) quando sono presenti in prova tutte le possibili combinazioni dei livelli di ogni fattore, oppure di esperimenti innestati (nested) quando i livelli di un fattore cambiano al cambiare dei livelli dell’altro.

Ad esempio:

Immaginiamo di voler studiare due fattori sperimentali: la varietà di girasole (tre livelli: A, B e C) e la concimazione (2 livelli: pollino e urea). Abbiamo quindi 6 possibili trattamenti (combinazioni): A-pollina, A-urea, B-pollina, B-urea, C-pollina e C-urea. Il disegno è completamente incrociato.
Immaginiamo di voler confrontare due specie in agricoltura biologica (orzo e triticale), con tre varietà ciascuna (A, B e C per orzo, D, E e F per triticale). Anche in questo caso abbiamo sei trattamenti: orzo-A, orzo-B, orzo-C, triticale-D, triticale-E e triticale-F, ma il disegno è innestato, perché per il fattore sperimentale ‘varietà’ i livelli cambiano a seconda dei livelli del fattore ‘specie’.

3.3.5 Aggiungere un controllo?

In alcuni casi si pone il problema di inserire in prova un trattamento che funga da riferimento per tutti gli altri. In questi casi si parla comunemente di controllo o testimone, che può essere

non sottosposto a trattamento
trattato con placebo
trattato secondo le modalità usuali di riferimento

3.3.6 Fattori sperimentali di trattamento e di blocco

Finora abbiamo menzionato quelli che, in lingua inglese, vengono definiti treatment factor (trattamenti sperimentali). Tuttavia, possono esserci altri fattori sperimentali non allocati, ma ‘innati’ e legati alla collocazione spazio-temporale o alle caratteristiche dei soggetti. Questi fattori vengono definiti, sempre in inglese, blocking factors. Di questi fanno parte, ad esempio, il blocco, la località ed ogni altro elemento che permette di raggruppare i soggetti. Anche questi blocking factors devono essere chiaramente identificati ed elencati.

Su questa base identifichiamo i fattori sperimentali negli esempi precedenti.

3.3.7 Casi di studio - 2

3.3.7.1 Esempio 1

Il fattore sperimentale oggetto di studio sarà il diserbo del pomodoro, con 5 livelli inseriti in prova (6 trattamenti sperimentali): A, B, C, D, E ed F. Inoltre, si ritiene opportuno inserire in prova un testimone non trattato (NT), che ci permetterà di quantificare la percentuale di malerbe controllate. Inoltre, sarà anche necessario inserire in prova un testimone scerbato manualmente (ST), che ci permetterà di quantificare eventuali perdite produttive dovute alla competizione residua o alla fitotossicità del trattamento. In totale, avremo quindi 8 tesi sperimentali. Come usuale in pieno campo, l’esperimento verrà disegnato a blocchi randomizzati e sarà pertanto necessario inserire un fattore di blocco.

3.3.7.2 Esempio 2

Il fattore sperimentale in studio sarà la varietà di girasole con 3 livelli inclusi in prova (varietà A, B e C). Come testimone, inseriremo la varietà di riferimento per la zona (D). Dato che eseguiremo questa prova su un terreno nel quale vi sono due chiari gradienti di fertilità, disegneremo l’esperimento considerando due fattori di blocco: trasversale e longitudinale (spiego meglio tra poco…). Poichè dobbiamo valutare la stabilità produttiva, dovremo ripetere l’esperimento più volte (es. in tre anni diversi) e quindi avremo un secondo fattore sperimentale, incrociato con il primo.

3.3.7.3 Esempio 3

In questo caso avremo due fattori sperimentali incrociati: il diserbo con due livelli (totale o parziale, localizzato sulla fila) e la lavorazione con tre livelli (aratura profonda, aratura superficiale e minimum tillage). Non vi è la necessità di un testimone, ma avremo la necessità di un fattore di blocco. In totale, avremo sei tesi sperimentali.

3.3.7.4 Esempio 4

Il fattore sperimentale in studio sarà la varietà di erba medica con 3 livelli inclusi in prova (varietà A, B e C) ai quali aggiungiamo il riferimento di zona (D) come testimone. Come nel caso del girasole, dovremo valutare la stabilità produttiva negli anni, ma, dato che abbiamo una coltura poliennale, non avremo bisogno di ripetere la prova, ma potremo ripetere le osservazioni per quattro anni sulla stessa prova.

3.3.7.5 Esempio 5

Per questo esperimento vengono considerate tre diverse modalità di confezionamento (carta, busta di plastica, scatola di plastica perforata). Non vi è necessità di un testimone, ma, dato che le diverse confezioni verranno acquistate in diversi supermercati e dato che sospettiamo differenze nella conservazione tra un supermercato e l’altro, utilizzeremo il supermercato come fattore di raggruppamento.

3.3.8 Identificazione delle unità sperimentali e delle repliche

3.3.8.1 Cornice di campionamento e numero di repliche

Per i primi quattro esempi verranno eseguite prove di pieno campo, nella Media Valle del Tevere, che rappresenta la cornice di campionamento adeguata per l’obiettivo previsto. Sappiamo di dover selezionare appezzamenti di terreno

rappresentativi della Media Valle del Tevere,
omogenei.

L’omogeneità dell’ambiente è fondamentale per aumentare la precisione dell’esperimento. La scelta dell’appezzamento è chiaramente fondamentale ed è guidata dall’esperienza, tenendo conto anche di aspetti come la facilità di accesso e la vicinanza di strutture (laboratori, capannoni…) che consentano un’accurata esecuzione degli eventuali prelievi.

Oltre alla scelta dell’appezzamento, si possono anche utilizzare alcune strategie per favorire una buona omogeneità delle parcelle. Spesso si usa far precedere la prova da una coltura di ‘omogeneizzazione’, ad esempio avena, che è molto avida di azoto e lascia nel terreno poca fertilità residua. Oppure un prato di erba medica, che, grazie agli sfalci periodici, lascia il terreno libero da piante infestanti.

Trattandosi di esperimenti di campo, il numero di repliche sarà di quattro, per ogni trattamento e l’unità sperimentale sarà una parcella, della quale dovremo valutare forma e dimensioni.

Per il quinto esempio, la cornice di campionamento sarà data dal territorio del comune di Perugia. L’unità sperimentale sarà la confezione e la scelta del numero di repliche dovrà essere compatibile con la capacità di analisi per la determinazione dell’inquinamento da micotossine. E’ ragionevole pensare che 30 repliche (90 confezioni totali) possano essere adeguate per rappresentatività e facilità di gestione.

3.3.8.2 Campionamento delle unità sperimentali

Per le quattro prove di pieno campo, una volta scelto l’appezzamento, dovremo campionare le parcelle di terreno. Questa operazione viene usualmente eseguita su carta, redigendo la mappa dell’esperimento. In primo luogo, si decide la dimensione e la forma della parcella.

L’aspetto fondamentale è che ogni parcella deve contenere un numero di piante sufficientemente alto da essere rappresentativo. Per questo motivo le colture a bassa fittezza hanno sempre bisogno di parcelle più grandi che non quelle ad alta fittezza. La dimensione non deve tuttavia eccedere una certa soglia, in quanto con essa aumenta anche la variabilità del terreno e, di conseguenza, diminuisce l’omogeneità dell’esperimento. Per questo motivo, talvolta si preferisce diminuire la dimensione delle parcelle ed, avendo lo spazio sufficiente, aumentare il numero delle repliche.

Nello stabilire la dimensione delle parcelle, dovremo tener conto del fatto che la parte più delicata è il bordo, in quanto le piante che si trovano lungo il bordo esterno risentono di condizioni diverse dalle altre piante situate al centro della parcella (effetto bordo). Questo determina variabilità all’interno della parcella, che possiamo minimizzare raccogliendo solo la parte centrale. Si viene così a distinguere la superficie totale della parcella dalla superficie di raccolta (superficie utile), che può essere anche molto minore di quella totale.

In generale si ritiene che le colture ad elevata fittezza (frumento, cereali, erba medica…) dovrebbero avere parcelle di almeno 10-20 \(m^2\), mentre a bassa fittezza (mis, girasole…) dovrebbero avere parcelle di almeno 20-40 \(m^2\). Queste dimensioni sono riferite alla superficie utile di raccolta, non alla dimensione totale.

Per quanto riguarda la forma, le parcelle quadrate minimizzano l’effetto bordo, perché, a parità di superficie, hanno un perimetro più basso. Tuttavia esse sono di più difficile gestione, in quanto, considerando il fronte di lavoro di una seminatrice o una mietitrebbiatrice parcellare, possono richiedere la semina o la raccolta in più passate, il che finisce per essere una fonte di errore. Per questo motivo le parcelle sono usualmente rettangolari, con una larghezza pari a quella della macchina impiegata per la semina.

Per i quattro esempi in studio potremmo utilizzare una dimensione delle parcelle di 20 \(m^2\) per l’erba medica (2 m di larghezza per 10 m di lunghezza) e di 22.5 \(m^2\) per pomodoro, mais e barbabietola da zucchero (2.25 m di larghezza per 10 metri di lunghezza).

A questo punto possiamo redigere la mappa per il primo esempio. Dato che il campo di prova è largo 30 metri e lungo 400 metri, potremmo immaginare di disegnare otto file di percelle in senso trasversale (8 x 2.25m = 18m), di modo che l’esperimento non sia troppo lungo (il che ne aumenterebbe la variabilità), ma rimanga spazio sufficiente ai lati, per evitare di avvicinarsi troppo alle scoline, dove possono manifestarsi ristagni idrici.

La mappa dell’esperimento è un elemento fondamentale e deve riportare tutte le informazioni relative al disegno sperimentale. E’anche importante indicare la direzione del Nord, in modo da facilitare l’orientamento della mappa stessa. Notare inoltre che, intorno alla prova, abbiamo sistemato altre parcelle fuori esperimento con funzione di ‘bordi’. In questo modo si evita che i bordi esterni delle parcelle esterne siano esposti a condizioni molto diverse dagli altri, cosa che potrebbe accentuare l’effetto ‘bordo’, di cui abbiamo parlato in precedenza. Queste parcelle verranno trattate in modo ordinario (semina e diserbo tradizionale del pomodoro).

Mappa dell’esperimento relativo all esempio 1

Per l’esperimento relativo all’esempio 5, l’unità sperimentale è una singola confezione di datteri, con le tipologie previste dal piano.

Tipologie delle confezioni di datteri

Siccome è abbastanza scomodo campionare confezioni di datteri casualmente all’interno del Comune di Perugia, si preferisce un campionamento stratificato, selezionando 10 supermercati rappresentativi, nelle zone più densamente popolate della città. All’interno di ogni supermercato, si selezioneranno casualmente tre repliche per ogni tipo di confezione.

3.3.9 Scelta delle variabili da rilevare

Durate e al termine dell’esperimento, sarà necessario rilevare le più importanti caratteristiche dei soggetti sperimentali, sia quelle innate, sia quelle indotte dai trattamenti sperimentali. Per ogni singolo carattere, l’insieme delle modalità/valori che ognuno dei soggetti presenta prende il nome di variabile (proprio perché varia, cioè assume diversi valori, a seconda del soggetto). Ad esempio, quando stiamo studiando l’effetto di due diserbanti su piante infestanti appartenenti ad una certa specie, posto che l’unità sperimentale è costituita da una singola pianta, possiamo avere le seguenti variabili: il prodotto diserbante con cui ogni pianta è stata trattata, il peso di ogni pianta prima del trattamento, il peso di ogni pianta dopo il trattamento.

Le variabili sperimentali possono essere molto diverse tra di loro ed è piuttosto importante saperle riconoscere, perché questo condiziona il tipo di analisi statistica da eseguire.

3.3.9.1 Variabili nominali (categoriche)

Le variabili nominali esprimono, per ciascun soggetto, l’appartenenza ad una determinata categoria o raggruppamento. L’unica caratteristica delle categorie è l’esclusività, cioè un soggetto che appartiene ad una di esse non puà appartenere a nessuna delle altre. Variabili nominali sono, ad esempio, il sesso, la varietà, il tipo di diserbante impiegato, la modalità di lavorazione e così via. Le variabili categoriche permettono di raggruppare i soggetti, ma non possono essere utilizzate per fare calcoli, se non per definire le proporzioni dei soggetti in ciascun gruppo.

3.3.9.2 Variabili ordinali

Anche le variabili ordinali esprimono, per ciascun soggetto, l’appartenenza ad una determinata categoria o raggruppamento. Tuttavia, le diverse categorie sono caratterizzate, oltre che dall’esclusività, anche da una relazione di ordine, nel senso che è possibile stabilire una naturale graduatoria tra esse. Ad esempio, la risposta degli agricoltori a domande relative alla loro percezione sull’utilità di una pratica agronomicapuò essere espressa utilizzando una scala con sei categorie (0, 1, 2, 3, 4 e 5), in ordine crescente da 0 a 5. Di conseguenza possiamo confrontare categorie diverse ed esprimere un giudizio di ordine (2 è maggiore di 1, 3 è minore di 5), ma non possiamo eseguire operazioni matematiche, tipo sottrarre dalla categoria 3 la categoria 2 e così via, dato che la distanza tra le categorie non è necessariamente la stessa.

3.3.9.3 Variabili quantitative discrete

Le variabili discrete sono caratterizzate dal fatto che possiedono, oltre alle proprietà dell’esclusività e dell’ordine, anche quella dell’equidistanza tra gli attributi (es., in una scala a 5 punti, la distanza – o la differenza – fra 1 e 3 è uguale a quella fra 2 e 4 e doppia di quella tra 1 e 2). Le variabili discrete consentono la gran parte delle operazioni matematiche e, spesso, possono essere analizzate con metodiche parametriche, facendo riferimento alla distribuzione normale, che, pur essendo continua, in alcune condizioni può essere assunta come buona approssimazione di molte distribuzioni discrete.

3.3.9.4 Variabili quantitative continue

Le variabili quantitative continue possiedono tutte le proprietà precedentemente esposte (esclusività delle categorie, ordine, distanza) oltre alla continuità, almeno in un certo intervallo. Tipiche variabili continue sono l’altezza, la produzione, il tempo, la fittezza…

Dato che gli strumenti di misura nella realtà sono caratterizzati da una certa risoluzione, si potrebbe arguire che misure su scala continua effettivamente non esistono. Tuttavia questo argomento è più teorico che pratico e, nella ricerca biologica, consideriamo continue tutte le misure nelle quali la risoluzione dello strumento è sufficientemente piccola rispetto alla grandezza da misurare. Viceversa, le variabili continue sono piuttosto rare nelle scienze economiche e sociali in genere.

La quantità di informazione fornita dagli strumenti di valutazione cresce passando dalle scale nominali, di più basso livello, a quelle quantitative continue, di livello più elevato. Variabili esprimibili con scale quantitative continue o discrete possono essere espresse anche con scale qualitative, adottando un’opportuna operazione di classamento. Il contrario, cioè traformare in quantitativa una variabile qualitativa, non è invece possibile.

3.3.9.5 Rilievi visivi e sensoriali

Nella pratica sperimentale è molto frequente l’adozione di metodi di rilievo basati sull’osservazione di un fenomeno attraverso uno dei sensi (più spesso, la vista, ma anche gusto e olfatto) e l’assegnazione di una valutazione su scala categorica, ordinale o, con un po’ di prudenza, quantitativa discreta o continua. Ad esempio, il ricoprimento delle piante infestanti, la percentuale di controllo di un erbicida e la sua fitotossicità vengono spesso rilevati visivamente, su scale da 0 a 100 o simili.

I vantaggi di questa tecnica sono molteplici:

Basso costo ed elevata velocità
Possibilità di tener conto di alcuni fattori perturbativi esterni, che sono esclusi dalla valutazione, contrariamente a quello che succede con metodi oggettivi di misura
non richiede strumentazione costosa

A questi vantaggi fanno da contraltare alcuni svantaggi, cioè:

Minor precisione (in generale)
Soggettività
L’osservatore può essere prevenuto
Difficoltà di mantenere uniformità di giudizio
Richiede esperienza specifica e allenamento

I rilievi sensoriali sono ben accettati nella pratica scientifica in alcuni ambiti ben definiti, anche se richiedono attenzione nell’analisi dei dati non potendo essere assimilati tout court con le misure oggettive su scala continua.

3.3.9.6 Variabili di confondimento

Quando si pianificano i rilievi da eseguire, oppure anche nel corso dell’esecuzione di un esperimento, bisogna tener presente non soltanto la variabile che esprime l’effetto del trattamento, ma anche tutte le variabili che misurano possibili fattori di confondimento.

Ad esempio, immaginiamo di voler valutare la produttività di una specie arborea in funzione della varietà. Immaginiamo anche di sapere che, per questa specie, la produttività dipende anche dall’età. Se facciamo un esperimento possiamo utilizzare alberi della stessa età per minimizzare la variabilità dei soggetti. Tuttavia, se questo non fosse possibile, per ogni albero dobbiamo rilevare non solo la produttività, ma anche l’età, in modo da poter valutare anche l’effetto di questo fattore aggiuntivo e separarlo dall’effetto della varietà. In questo modo l’esperimento diviene molto più preciso.

3.3.10 Casi di studio - 3

Per gli esempi in studio, immaginiamo per semplicità di dover rilevare la produzione per gli esempi da 1 a 4 e il contenuto di micotossine per l’esempio 5. Inoltre, per l’esempio 2, immaginiamo di dover rilevare anche il peso di mille semi. Per questo, prenderemo dalla produzione di granella di ogni parcella, quattro subcampioni da mille semi, da sottoporre a successive misure.

3.3.11 Allocazione dei trattamenti

Il problema dell’allocazione dei trattamenti non si pone con l’esempio 5, in quanto, trattandosi di un esperimento osservazionale, le confezione sono già ‘naturalmente’ trattate, cioè appartengono già, all’atto del campionamento, alla tipologia di confezionamento prescelta.

Per quanto riguarda gli altri esempi, abbiamo già redatto la mappa secondo le necessità. A questo punto si pone il problema di decidere quali parcelle trattare con cosa, nel rispetto dei trattamenti e delle repliche prescelte. Per questo fine, semplici esperimentipossono anche essere disegnati a mano; per esperimenti più complessi potremo utilizzare il package agricolae in R (de Mendiburu, 2017).

3.3.12 Casi di studio - 4

3.3.12.1 Esempio 1

Questo esempio va disegnato a blocchi randomizzati; tuttavia, a titolo di esempio, esamineremo anche la possibilità che venga disegnato a randomizzazione completa. Quest’ultimo disegno è il più semplice e consiste nell’assegnare ogni trattamento a quattro parcelle casualmente scelte. Con R bisognerà prima creare il vettore dei nomi delle tesi e il numero di repliche per tesi

library(agricolae)
trt <- c("A", "B", "C", "D", "E", "F", "NT", "TS")
reps <- rep(4, 8)
design <- design.crd(trt, r=reps, seed=777, serie=0)
design$book

##    plots r trt
## 1      1 1   E
## 2      2 1   C
## 3      3 1   B
## 4      4 2   C
## 5      5 1   F
## 6      6 1  TS
## 7      7 1  NT
## 8      8 1   D
## 9      9 2  NT
## 10    10 1   A
## 11    11 2  TS
## 12    12 2   F
## 13    13 3  NT
## 14    14 3   C
## 15    15 3  TS
## 16    16 2   D
## 17    17 3   D
## 18    18 2   E
## 19    19 3   E
## 20    20 4  NT
## 21    21 2   A
## 22    22 4   D
## 23    23 4   E
## 24    24 3   A
## 25    25 4   C
## 26    26 2   B
## 27    27 4   A
## 28    28 3   F
## 29    29 3   B
## 30    30 4  TS
## 31    31 4   F
## 32    32 4   B

Possiamo ora riportare la randomizzazione sulla mappa disegnata in precedenza.

Schema sperimentale a randomizzazione completa per l’Esempio 1

Questo schema è eccellente se l’ambiente è molto uniforme. Tuttavia, nel caso di un esperimento di camp è lecito aspettarsi un gradiente trasversale, dato che il campo sarà certamente meno fertile vicino alle scoline. Per questo motivo disegneremo l’esperimento a blocchi randomizzati, dividendo prima l’appezzamento in quattro blocchi perpendicolari al gradiente di fertilità. Ad esempio il blocco 1 conterrà le parcelle 1, 9, 17, 25 2, 10, 18 e 26, cioè le prime due colonne della mappa, con un numero di parcellè esattamente uguali al numero delle tesi. Il blocco 2 conterrà le colonne 3 e 4 e così via. Dato che il gradiente è trasversale, le parcelle di un stesso blocco saranno più omogenee che non parcelle su blocchi diversi. Dopo aver diviso la mappa in quattro blocchi di otto parcelle, possiamo allocare gli otto trattamenti a random all’interno di ogni blocco. Con R è possibile utilizzare il codice seguente (notare che la numerazione assegnata da R è diversa dalla nostra, anche se possiamo far riferimento ai valori crescenti all’interno di ogni blocco).

reps <- 4
designRCBD <- design.rcbd(trt, r=reps, seed=777, serie=2)
book2 <- designRCBD$book
book2

##    plots block trt
## 1    101     1   E
## 2    102     1   B
## 3    103     1  NT
## 4    104     1   F
## 5    105     1   D
## 6    106     1  TS
## 7    107     1   C
## 8    108     1   A
## 9    201     2   F
## 10   202     2   A
## 11   203     2   C
## 12   204     2   E
## 13   205     2  TS
## 14   206     2   B
## 15   207     2  NT
## 16   208     2   D
## 17   301     3  TS
## 18   302     3  NT
## 19   303     3   F
## 20   304     3   A
## 21   305     3   B
## 22   306     3   E
## 23   307     3   C
## 24   308     3   D
## 25   401     4   D
## 26   402     4  TS
## 27   403     4   A
## 28   404     4   F
## 29   405     4   E
## 30   406     4   C
## 31   407     4   B
## 32   408     4  NT

zigzag(designRCBD) # zigzag numeration

##    plots block trt
## 1    101     1   E
## 2    102     1   B
## 3    103     1  NT
## 4    104     1   F
## 5    105     1   D
## 6    106     1  TS
## 7    107     1   C
## 8    108     1   A
## 9    208     2   F
## 10   207     2   A
## 11   206     2   C
## 12   205     2   E
## 13   204     2  TS
## 14   203     2   B
## 15   202     2  NT
## 16   201     2   D
## 17   301     3  TS
## 18   302     3  NT
## 19   303     3   F
## 20   304     3   A
## 21   305     3   B
## 22   306     3   E
## 23   307     3   C
## 24   308     3   D
## 25   408     4   D
## 26   407     4  TS
## 27   406     4   A
## 28   405     4   F
## 29   404     4   E
## 30   403     4   C
## 31   402     4   B
## 32   401     4  NT

print(designRCBD$sketch)

##      [,1] [,2] [,3] [,4] [,5] [,6] [,7] [,8]
## [1,] "E"  "B"  "NT" "F"  "D"  "TS" "C"  "A" 
## [2,] "F"  "A"  "C"  "E"  "TS" "B"  "NT" "D" 
## [3,] "TS" "NT" "F"  "A"  "B"  "E"  "C"  "D" 
## [4,] "D"  "TS" "A"  "F"  "E"  "C"  "B"  "NT"

Anche in questo caso, riportiamo tutto sulla mappa.

Schema sperimentale a blocchi randomizzati per l’Esempio 1

3.3.12.2 Esempio 2

In questo caso, per ognuno dei tre anni di prova, la mappa contiene una griglia 4 x 4, analoga a quella dell’esperimento precedente, ma più piccola. Nella mappa potremo quindi identificare, esclusi i bordi, quattro colonne e quattro righe. Dato che abbiamo presupposto l’esistenza di un gradiente trasversale e lungitudinale (tra righe e tra colonne), l’allocazione dei trattamenti dovrà esser fatta in modo che ognuno di essi si trovi su ogni riga e ogni colonna. Questo tipo di disegno prende il nome di Quadrato latino.

Anche in questo caso potremo chiedere ad R di aiutarci a trovare la combinazione corretta (anche se questo potrebbe essere comodamente fatto a mano).

trt <- c("A", "B", "C", "D")
designLS <- design.lsd(trt, seed=543, serie=2)
designLS$book

##    plots row col trt
## 1    101   1   1   C
## 2    102   1   2   A
## 3    103   1   3   B
## 4    104   1   4   D
## 5    201   2   1   D
## 6    202   2   2   B
## 7    203   2   3   C
## 8    204   2   4   A
## 9    301   3   1   B
## 10   302   3   2   D
## 11   303   3   3   A
## 12   304   3   4   C
## 13   401   4   1   A
## 14   402   4   2   C
## 15   403   4   3   D
## 16   404   4   4   B

Schema sperimentale a quadrato latino per l’Esempio 2 (un anno)

A questo punto dobbiamo considerare che questa prova deve essere ripetuta in tre anni. La ripetizione di una prova è sempre fondamentale, in quanto consente di verificare non solo la replicabilità dell’esperimento (che è dimostrata dalle repliche), ma anche la sua riproducibilità (riguardare le definizioni di replicabilità e riproducibilità). In questo caso poi la ripetizione dell’esperimento è indispensabile per misurare la stabilità produttiva, cioè l’oscillazione delle produzioni da un anno all’altro.

Ovviamente è anche importante verificare la stabilità produttiva da una località all’altra, che consente di valutare l’esistenza di macro-areali, nei quali è possibile consigliare le stesse varietà. Un’aspetto fondamentale è comunque quello di definire una diversa randomizzazione in ogni anno/località, per evitare che le stesse varietà siano sempre nelle stesse posizioni, che potrebbe dare origine a dubbi di confounding. La definizione delle randomizzazioni per il secondo e terzo anno è lasciata per esercizio.

Un’altro aspetto da considerare è la metodica impiegata per la determinazione del peso di 1000 semi. Abbiamo già visto che, per aumentare la precisione e la rappresentatività, da tutta la granella raccolta da una parcella preleviamo quattro lotti da 1000 semi, di cui determinare il peso. In questo modo, per ogni trattamento avremo 16 valori (quattro repliche x quattro lotti per replica). Ovviamente non possiamo affermare di avere 16 repliche, in quanto solo le parcelle sono da considerare repliche, in quanto ricevono il trattamento (varietà) in modo indipendente. I quattro lotti raccolti da ogni parcella sono unità osservazionali (perché ne viene rilevato il peso), ma non unità sperimentali, perché appartengono alla stessa parcella e non sono indipendenti. I quattro lotti si dicono sub-repliche, quindi il disegno ha quattro repliche e quattro sub-repliche per replica (disegno a quadrato latino con sottocampionamento). I due strati di errore (variabilità tra repliche e variabilità tra sub-repliche entro replica), devono essere mantenuti separati in fase di analisi, altrimenti l’analisi è invalida, perché è condotta come se avessimo un più alto grado di precisione (16 repliche) rispetto a quello che abbiamo effettivamente (una sorta di millantato credito!).

3.3.12.3 Esempio 3

In questo caso abbiamo un disegno fattoriale con due livelli a blocchi randomizzati. Nel principio, questo disegno non ha nulla di diverso da quello relativo all’esempio 1, fatto salvo un minor numero di trattamenti (solo 6). Anche in questo caso, ci facciamo aiutare da R.

trt <- c(3,2) # factorial 3x2
design2way <-design.ab(trt, r=4, serie=2, design="rcbd", seed=777)
book <- design2way$book
levels(book$A) <- c("PROF", "SUP", "MIN")
levels(book$B) <- c("TOT", "PARZ")
book

##    plots block    A    B
## 1    101     1  SUP PARZ
## 2    102     1 PROF PARZ
## 3    103     1 PROF  TOT
## 4    104     1  MIN  TOT
## 5    105     1  SUP  TOT
## 6    106     1  MIN PARZ
## 7    107     2  MIN  TOT
## 8    108     2  SUP  TOT
## 9    109     2  MIN PARZ
## 10   110     2 PROF  TOT
## 11   111     2  SUP PARZ
## 12   112     2 PROF PARZ
## 13   113     3  MIN  TOT
## 14   114     3  SUP  TOT
## 15   115     3 PROF PARZ
## 16   116     3  MIN PARZ
## 17   117     3  SUP PARZ
## 18   118     3 PROF  TOT
## 19   119     4  MIN PARZ
## 20   120     4 PROF  TOT
## 21   121     4 PROF PARZ
## 22   122     4  MIN  TOT
## 23   123     4  SUP  TOT
## 24   124     4  SUP PARZ

La mappa risultante è visibile più sotto.

Schema sperimentale fattoriale a blocchi randomizzati per l’Esempio 3

Questo disegno è totalmente appropriato, ma ci costringe a lasciare parecchio spazio tra una parcella e l’altra, per poter manovrare con la macchina per la lavorazione del terreno. Sarebbe utile raggruppare le parcelle caratterizzate dalla stessa lavorazione, in modo da poter lavorare su superfici più ampie. Ne guadagnerebbe l’uniformità dell’esperimento e l’accuratezza dei risultati. Possiamo quindi immaginare un disegno a un fattore, con parcelle di dimensione doppia (main-plots), sulle quali eseguire, in modo randomizzato le lavorazioni del terreno. Succesivamente, ogni main-plot può essere suddivisa in due e, su ognuna delle due metà, possono essere allocati in modo random i due trattamenti di diserbo. In questo modo ci troviamo ad operare con parcelle di due dimensioni diverse: le main-plots per le lavorazioni e le sub-plots per il diserbo. Questo tipo di schema prende il nome di parcella suddivisa (split-plot), ed è piuttosto comune nella sperimentazione di pieno campo.

Proviamo ad utilizzare R per redigere il piano sperimentale.

lavorazione <- c("PROF", "SUP", "MIN")
diserbo <- c("TOT", "PARZ")
designSPLIT <- design.split(lavorazione, diserbo, r=4, serie=2, seed=777)
book <- designSPLIT$book
book

##    plots splots block lavorazione diserbo
## 1    101      1     1         SUP    PARZ
## 2    101      2     1         SUP     TOT
## 3    102      1     1        PROF     TOT
## 4    102      2     1        PROF    PARZ
## 5    103      1     1         MIN    PARZ
## 6    103      2     1         MIN     TOT
## 7    104      1     2         SUP    PARZ
## 8    104      2     2         SUP     TOT
## 9    105      1     2         MIN     TOT
## 10   105      2     2         MIN    PARZ
## 11   106      1     2        PROF     TOT
## 12   106      2     2        PROF    PARZ
## 13   107      1     3         MIN     TOT
## 14   107      2     3         MIN    PARZ
## 15   108      1     3         SUP     TOT
## 16   108      2     3         SUP    PARZ
## 17   109      1     3        PROF     TOT
## 18   109      2     3        PROF    PARZ
## 19   110      1     4        PROF    PARZ
## 20   110      2     4        PROF     TOT
## 21   111      1     4         MIN     TOT
## 22   111      2     4         MIN    PARZ
## 23   112      1     4         SUP    PARZ
## 24   112      2     4         SUP     TOT

Schema sperimentale split-plot a blocchi randomizzati per l’Esempio 3

In alcune circostanze, soprattutto nelle prove di diserbo chimico, potrebbe trovare applicazione un altro tipo di schema sperimentale, nel quale, in ogni blocco, un trattamento viene applicato a tutte le parcelle di una riga e l’altro trattamento a tutte le parcelle di una colonna. Ad esempio, il disegno sottostante mostra una prova nella quale il terreno è stato diserbato in una striscia nel senso della lunghezza e, dopo il diserbo, le colture sono state seminate in striscia, nel senso della larghezza. Questo disegno è detto strip-plot ed è molto comodo perché consente di lavorare velocemente.

Schema sperimentale strip-plot

3.3.12.4 Esempio 4

La prova di erba medica è fondamentalmente un esperimento a blocchi randomizzati, il cui piano è riportato più sotto. Tuttavia, si tratta di una coltura poiliennale nella quale ripeteremo le misurazioni ogni anno sulle stesse parcelle. le misure ripetute non sono randomizzate (non possono esserlo), ma seguono una metrica temporale. Proprio per questo sviluppo lungo la scala del tempo, i dati che si raccolgono in questi esperimenti a misure ripetute sono detti dati longitudinali. Guardando bene il disegno si capisce anche per si parla di split-plot nel tempo. Esempi affini sono relativi all’analisi di accrescimento con misure non distruttive (esempio l’altezza) oppure i prelievi di terreno a profondità diverse, anche se, in quest’ultimo caso, la metrica delle misure ripetute è spaziale, non temporale.

Si può notare una certa analogia con il sottocampionamento illsutrato più sopra, nel senso che vengono prese più misure per parcella. Tuttavia, bisogna tener presente che nel sottocampionamento le diverse misure sono solo repliche e non vi è nessuna esigenza di distinguere tra quelle prese nella stessa parcella. Invece, nel caso delle misure ripetute ognuna di esse ha interesse individuale, in quanto espressione di un’anno particolare.

Schema sperimentale a blocchi randomizzati con misure ripetute

3.3.12.5 Esempio 5

Per questo disegno osservazionale, la mappa non è necessaria. Tuttavia, si può notare che, in ogni supermercato, abbiamo un disegno a randomizzazione completa, con tre tipi di confezioni e tre repliche, cioè nove confezioni scelte a random da un lotto più grande. Insomma, si tratta di un esperimento ripetuto 9 volte che, pertanto, ha una certa affinità con l’esperimento ripetuto dell’Esempio 2.

3.3.13 Impianto delle prove

Da questo punto in poi, subentrano le competenze agronomiche e fitopatologiche necessarie per codurre gli esperimenti, Mi piace solo ricordare alcune pratiche usuali nella sperimentazione di pieno campo, destinate a migliorare l’efficienza della prova.

Seminare a densità più alte e poi diradare, per assicurare una migliore uniformità di impianto
Prelevare da ogni parcella più campioni ed, eventualmente, omogeneizzarli o mediare i risultati ottenuti (vedi il caso dei 1000 semi)
Considerare le caratteristiche naturalmente meno variabili (es. la produzione areica e non la produzione per pianta)

Voglio inoltre ricordare che gli esperimenti parcellari configurano una situazione nella quale, per l’elevata cura che si pone nelle tecniche agronomiche, si riesce ad ottenere una produttività almeno del 20% superiore rispetto a quanto avviene nella normale pratica agricola.

3.4 Come scrivere un progetto di ricerca o un report di ricerca

Quanto abbiamo finora esposto costituisce uno schema generale che può essere adottato per redigere un progetto di ricerca o un report sui risultati ottenuti (tesi, pubblicazione). Bisogna provare che la ricerca che si è eseguita è precisa, accurata e replicabile/riproducibile e, di conseguenza, i risultati sono validi.

Nella redazione di un progetto di ricerca o di un report, è fondamentale tratteggiare bene i seguenti elementi:

Titolo della ricerca
Descrizione del problema e background scientifico
Ipotesi scientifica, motivazioni e obiettivi
Tipo di esperimento e durata
Disegno sperimentale: trattamenti sperimentali (tesi) a confronto con dettagli relativi all’applicazione
Unità sperimentali e criteri per la loro selezione. Dettagli su repliche e randomizzazione
Dettagli su eventuali tecniche di ‘blocking’
Variabili da rilevare/rilevate
Dettagli su come le variabili saranno/sono state rilevate
Esposizione dei risultati (solo report)
Discussione (solo report)
Conclusioni (solo report)

Alcuni aspetti che divengono elemento di valutazione del progetto e/o del report sono i seguenti:

La selezione dei metodi deve essere coerente con gli obiettivi
Descrizione dettagliata dei materiali e metodi (bisogna che chiunque sia in grado di replicare l’esperimento)
Esposizione dei risultati chiara e convincente
Discussione approfondita e con molti riferimenti alla letteratura.

3.5 Per approfondimenti

Hurlbert, S., 1984. Pseudoreplication and the design of ecological experiments. Ecological Monographs, 54, 187-211
Kuehl, R. O., 2000. Design of experiments: statistical principles of research design and analysis. Duxbury Press (CHAPTER 1)
LeClerg, E.; Leonard, W. & Clark, A., 1962. Field Plot Technique. Burgess Publishing Company, (CHAPTER 3)
Felipe de Mendiburu (2017). agricolae: Statistical Procedures for Agricultural Research. R package, version 1.2-8. https://CRAN.R-project.org/package=agricolae